基因修饰骨组织工程技术研究进展
时间：2023-08-16 04:30:43
基因修饰骨组织工程技术研究进展一文创作于：2023-08-16 04:30:43，全文字数：14758。
基因修饰骨组织工程技术研究进展 非病毒物理载体非病毒物理载体技术主要包括基因枪法、声穿孔法、电穿孔法和磁转染法等。
基因枪法又称生物弹道技术或微粒轰击技术，其利用微粒加速装置，将载有基因的重金属元素颗粒打入细胞或组织。声穿孔法和电穿孔法可提高细胞膜渗透性，以增加基因进入细胞的效率。Kawai 等[1]将BMP-2/7基因通过电穿孔法转移到大鼠牙周组织中，于转染后第3 天检测到2 种基因的表达，第5 天检测到牙槽部位的新骨形成。电穿孔法和声穿孔法作为物理载体转染细胞已经得到广泛研究，两种方法各有优缺点，电穿孔法的转染效率更高且更为稳定，而声穿孔法对组织细胞的侵入性小，更为安全。
近年来，肽修饰物因穿过细胞膜能力强被广泛用于药物递送系统的研究中，其可负载多种大分子物质进入细胞而发挥作用，肽修饰的非病毒载体[6,12,27]和病毒载体[28]等新型载体同样在GMBTE 中展现出巨大潜力。细胞穿透肽是一类较小的短多肽序列，具有高穿透活性和稳定性的优点，为GMBTE 更安全地应用提供了可能性[29]。
未来的载体开发将不断优化病毒载体的安全性和非病毒载体的转染效率，理想载体应为高转染效率、低毒性和无免疫原性的合理统一。
3 基因投递方式
GMBTE 的核心问题是如何将基因载体导入宿主骨缺损部位进行过表达，按其投递方式可分为体内基因投递和体外基因投递。
3.1 体内基因投递
体内基因投递是将基因载体直接注射入宿主体内。此方式操作简单、成本低廉，并可避免因采集自体细胞引起的相关并发症。Betz 等[30]开展研究将Ad-BMP-2 经皮注射到病灶内，发现可在8 周内诱导大鼠5 mm 股骨缺损愈合，修复组织是以骨小梁为主的矿化骨。Ishihara 等[31]对直接注射Ad-BMP-2 与细胞介导的Ad-BMP-2 两种方式治疗马肋骨骨缺损进行比较研究，发现细胞介导组能更有效地促进骨生成，这可能是因为细胞介导组拥有较高的转染效率，且可增加骨缺损部位的细胞密度，而这些显然是直接注射基因载体复合物所欠缺的。直接注射法还存在基因载体从植入部位扩散而造成异位骨化或安全隐患的问题。
为了避免或减轻基因和载体的异位扩散，可将载体附着在基因活化基质(GAM)上来完成体内基因投递。GAM 可保护基因免受细胞外屏障的攻击，包括免疫系统的攻击和血清核酸酶或蛋白酶的降解。Zhang 等[32]开发了一种高度稳定、无毒性作用且编码BMP-2 的化学修饰RNA（cmRNA），当将其加载到胶原海绵中时可持续释放cmRNA。他们开展的体内研究证明，cmRNA 组骨缺损区拥有更成熟的骨结构，且存在软骨内骨化过程。有学者对BMP-2质粒投递方式采用GAM 形式还是细胞介导进行研究，发现在基因投递过程中，目的基因的产生量及产生时间对骨形成的作用比靶细胞的存在更为重要[33]，因此细胞接种或许不是转基因表达的必要条件。
体内基因投递的发展仍需克服很多障碍，因为宿主特定解剖部位的细胞种类较多，基因转染入靶细胞的难度较大，故此方式的转染效率低且存在基因异位表达的风险。此外，体内基因投递需要受损部位的细胞数量充足，故不适用于大段骨缺损和大面积软组织缺损的情况。
3.2 体外基因投递
3.2.1 常规体外基因投递
GMBTE 中的常规体外基因投递是在体外将基因载体转染入靶细胞，再将转基因细胞扩增后植入宿主体内。由于可对转基因细胞进行选择和测试，故此方式转染效率高、可控性强且相对安全，是最常用的基因投递方式。
Fan 等[34]研究发现，BMP-2 转染骨髓间充质干细胞（BMSC）可促进细胞的成骨分化作用，并分泌更多含钙离子成分的细胞外基质；在体内实验中，转染基因组的炎性细胞明显减少，支架消失，且血管生成。常规体外基因投递需要进行2 次手术和侵入性细胞采集，并需要在良好的生产规范设施下培养和扩增细胞，这些步骤增加了成本和时间，且细胞特性发生变化和植入污染的风险也较高。
3.2.2 快速体外基因投递
为了克服常规体外基因投递的缺点，学者们开发了快速体外基因投递方式。
快速体外基因投递是将基因转染于组织而非单一的特定细胞，转基因组织为可生物降解的肌肉碎片[35]、脂肪碎片[36]、骨髓细胞[37]等，此方法因无需进行细胞的分离、培养、扩增，而使时间和成本均明显减少。Virk 等[38]开发了一种“当日”快速体外基因投递技术，即组织碎片的获取、转染和重新植入在1 次手术中完成。他们将大鼠骨髓细胞和LV-BMP-2 共培养1 h 后回植到大鼠骨缺损处，手术时间小于3 h。“当日”组手术后8 周时，骨缺损完全愈合，与传统组相比，其骨愈合时间更早，新生骨体积更大。与此不同，Bougioukli 等[37]分别采用快速体外基因投递法与常规体外基因投递法治疗裸鼠临界骨缺损，发现传统“两步”组（采用常规体外基因投递法）拥有更高的愈合率和新生骨质量。这可能是因为培养后的骨髓细胞与新鲜分离的骨髓细胞体内存活情况、转基因表达水平和持续时间不尽相同。
快速体外基因投递法可能在较大的骨缺损治疗中失败，而失败的代价往往是截肢，所以快速体外基因投递法有必要进一步完善。
4 展望
尽管GMBTE 已取得诸多进展，但尚未真正应用于临床，基因修饰可能带来的不良反应尚需要进一步优化。编码生长因子基因的单独应用或联合应用已经取得众多研究成果，miRNA 作为新的治疗靶点展现出巨大潜力，但其骨再生作用的相关机制还需要进一步研究。载体的选择多种多样，各有优劣，而新型载体（如细胞穿透肽）的研究刚刚起步，有望成为GMBTE 中最理想的载体。纵观基因导入细胞方式，从早期的基因载体直接皮下注射，到近年来基因载体复合支架或GAM 方式，GMBTE 技术逐渐成熟并在骨缺损治疗中取得良好效果，而快速基因投递为GMBTE 提供了新思路。未来GMBTE 技术靶基因的选择需要针对疾病发病机制进行个性化选择，载体构建和基因投递方式需要兼顾安全性和转染效率。
骨组织形成是复杂的级联事件，涉及受损部位多因子的时间依赖性表达，因此基因表达的时间、空间和水平调控变得尤为重要。生物支架和GAM的设计应模拟自然骨再生过程以促进骨组织再生。此外，时空调控还可通过基因开关系统如上述的“自杀式”时空调控系统来实现。随着GMBTE 研究的进展，其有望应用于临床，为骨缺损修复重建带来新的希望。
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